近日，山东大学微生物技术国家重点实验室祁庆生团队侯进教授在Nucleic Acids Research发表“CRISPR-mediated protein-tagging signal amplification systems for efficient transcriptional activation and repression inSaccharomyces cerevisiae”，开发CRISPR转录调控新工具。侯进教授为论文通讯作者，研究团队的博士生翟昊天为第一作者，山东大学为唯一完成单位和通讯作者单位。

酿酒酵母是一种重要的真核模型微生物，广泛地应用于基础研究和各种化学品的生产。高效、精确地控制多基因的表达，对转录调控极其重要。簇状有规律间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的转录调控能够实现复杂的基因表达编程，已广泛用于多基因的基因表达调控。然而，目前在酵母中应用的CRISPR调控系统，通常是将核酸酶缺陷的CRISPR蛋白与转录激活或抑制因子直接结合，其调控效率较低，限制了在合成生物学及代谢工程中的应用。

该工作在酿酒酵母中开发了CRISPR介导的蛋白质支架转录信号扩增系统，实现了转录调控信号的有效扩增，用于多基因的同时激活和抑制。作者首先通过筛选优化CRISPR系统中的转录调控因子，提高调控效率；在此基础上，创新性的在CRISPR系统中引入两套蛋白支架系统（SPY和SunTag系统），分别用于转录激活因子和抑制因子的招募，可同时将多个转录因子招募到核酸酶缺陷的CRISPR蛋白上，使转录调控效率显著提高，实现34.9倍的转录激活和95%的转录抑制，激活和抑制效率分别比转录因子与核酸酶缺陷的CRISPR蛋白直接融合的效率提高3.8倍和8.6倍，并且激活和抑制使用不同的CRISPR调控系统，信号之间不串扰，实现了调控信号的正交。在此基础上，利用正交的双功能CRISPR转录调控系统来调控3-羟基丙酸生物合成途径的相关基因的表达，显著提高了3-羟基丙酸的合成效率。

图1CRISPR介导的蛋白质支架转录信号扩增系统的设计原理

dCas9-SPY激活系统及dCpf1-SunTag抑制系统的设计

目前，CRISPR介导的调控系统已广泛用于各种转录调控，在基础研究及工程化改造中都发挥了重要的作用。但调控效率低，是限制该系统的一个重要问题。本研究首次在酵母中开发了CRISPR支架蛋白介导的信号扩增系统，通过招募转录因子，显著提高转录调控效率，实现了多个基因表达的高效编程，并且通过两套CRISPR蛋白支架调控系统的设计，实现了激活和抑制信号的正交，该系统比目前普遍应用的直接融合转录因子的CRISPR调控系统具有更好的基因调控效率，是一套新颖的CRISPR调控系统，在代谢工程和基础研究将有广泛的应用潜力。

文章链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkac463/6596094